PENGARUH EKSTRAK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica) TERHADAP

KADAR KALSIUM DARAH TIKUS PUTIH (Rattus Norvegicus) PASCA OVARIEKTOMI

ABSTRAK

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui proses mekanisme perubahan kadar kalsium serum akibat pemberian ekstrak daun pegagang pada tikus strain wistar Rattus norvegicus pasca ovariektomi. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental, dua puluh satu tikus betina, berusia tiga bulan, dan rerata berat badan dua ratus gram telah diovariektomi. Tikus penelitian diaacak menjadi tiga kelompok, tiap kelompok terdiri atas tujuh ekor tikus. Kelompok TO 60, dan TO 120 diberi ekstrak daun pegagang pada hari ke 21 pasca ovariektomi dengan dosis : 60 mg, and 120 mg/Kgbb/hari, berturut-turut per oral selama twenty days. Pada hari ke 41 pasca ovariectomy, tikus dieutanasia untuk pengambilan sampel darah. Serum kalsium dianalisis menggunakan metode cresolphthalein. Data dianalisis dengan One-way analysis of variance. Hasil penelitian menyimpulkan bahwa pemberian ekstrak daun pegagang yang mengandung phytoestrogen tidak memberikan perbedaan yang signifikan terhadap kadar kalsium serum pasca ovariektomi tikus.

Kata kunci: pegagang, ovariectomy, phytoestrogen.

PENDAHULUAN

Memasuki masa menopause, wanita tidak akan menyadari menderita osteoporosis. Osteoporosis perlahan tapi pasti akan menyebabkan pengeroposan tulang, sehingga meningkatkan resiko kejadian patah tulang (Gueldner et al., 2008). Menurut WHO, osteoporosis adalah penyakit tulang keseluruhan, diikuti dengan penurunan masa tulang, gangguan struktur tulang dan peningkatan resiko patah tulang (World Health Organization, 1994).

Osteoporosis yang berlangsung pada wanita menopause disebabkan karena tidak diproduksinya lagi hormon estrogen oleh ovarium (Basaria and Dobs, 2006). Diperkirakan 40% wanita dan 13% pria pada usia 50 tahun keatas menderita osteoporosis dan memiliki resiko tinggi kejadian patah tulang (Stevenson and Marsh., 2007).

Penelitian saat ini telah banyak mempublikasikan manfaat dan resiko penggunaan estrogen sebagai HRT (Hormon Replacement Therapy), terutama pada resiko penggunaan jangka panjang (Bracamont and Miller, 2001; Cano et al., 2001; Luyer et al., 2001). Hasil penelitian Women´s Health Initiative Group (2002), menunjukkan bahwa penggunaan estrogen tidak menunjukkan efek menurunkan resiko penyakit jantung koroner, tetapi menurunkan kejadian patah tulang akibat osteoporosis. Disamping itu dilaporkan juga bahwa penggunaan estrogen jangka panjang menyebabkan peningkatan kejadian, stroke, kangker payudara invasive, dan tromboembolisme vena.

Mengingat efek negatif penggunaan estrogen sebagai HRT membuat dunia medis kini mengalihkan HRT kepada penggunaan tumbuhan yang mengandung phytooestrogens. Phytooestrogens terbukti memberi efek perbaikan terhadap penderita osteoporosis melalui efeknya meningkatkan massa tulang. Pemakaian phytooestrogens aman untuk jangka panjang (Mario Chiechi and Micheli, 2005).

Pegagang (Centela asiatica) merupakan salah satu jenis flora Indonesia yang mengandung phytoestrogen. Daun pegagang sampai saat ini sering dimanfaatkan masyarakat sebagai bahan sayuran dan obat herbal (Choeruman, 2010). Daun pegagang diketahui mengandung bahan aktif berupa isoflavon, yang secara umum dikenal sebagai phytoestrogens (Kumar, 2006).

Ovariektomi menyebabkan peningkatan kadar kalsium darah, yang merupakan salah satu indikator terjadinya peningkatan proses resorpsi tulang (Nurdin dkk., 2002).

Branca (2003) menyimpulkan bahwa, isoflavon dapat menjadi pilihan untuk mengobati osteoporosis. Mengingat genistein mampu merangsang aktivitas osteoblast dan menghambat pembentukan osteoclast. Isoflavon juga efektif menghambat kehilangan tulang pada hewan yang menderita osteoporosis (Sugiyama et al, 2006).

Genistein meningkatkan pembentukan dan pemadatan tulang (Coxam, 2003). Genistein juga menghambat sintesis dan sekresi IL-6, sehingga berakibat menurunnya proses diferensiasi dan fungsi osteoclast. Karena proses difrerensiasi dan fungsi osteoclast menurun menyebabkan kalsium yang diresorpsi dari tulang akan berkurang, sehingga berakibat turunnya kadar kalsium darah (Yamaguchi and Gao, 1998; Arjmandi, 2001; Okamoto et al., 2001; Button, 2004; Bartl and Fisch, 2009;).

Ekstraksi daun pegagang dengan ethanol 60% dimaksudkan untuk mendapatkan bahan aktif isoflavon (Sudjadi, 1986).Penelitian tentang pengaruh ekstrak daun pegagang terhadap kadar kalsium darah tikus putih pasca ovariektomi belum pernah dilakukan sebelumnya.

Kadar kalsium darah sangat penting pada wanita menopause, karena dapat berfungsi sebagai indikator terjadinya osteoporosis. Digunakannya model tikus putih (Rattus norvegicus) ovariektomi dalam penelitian ini karena secara etis tidak memungkinkan dilakukan pada manusia. Analoginya diasumsikan menyerupai kejadian wanita menopause. Diharapkan dari tikus yang mengalami ovariektomi ini, akan diperoleh kondisi menyerupai defisiensi estrogen.

 Berdasarkan latar belakang diatas, maka dilakukan penelitian pengaruh ekstrak daun pegagang terhadap kadar kalsium darah tikus putih pasca ovariektomi. Bertujuan untuk mengukur pengaruh ekstrak daun pegagang terhadap kadar  kalsium darah yang diukur dengan metode cresolphtaelin pada  tikus putih pasca ovariektomi

METODE PENELITIAN

Perlakuan pada tikus betina sebelum pemberian ekstrak daun pegagang, terlebih dahulu membuat model tikus betina ovariektomi. Persiapan selanjutnya adalah pembuatan dan pengenceran ekstrak daun pegagang.

Bahan dan alat penelitian yang digunakan antara lain, Daun pegagang, n-heksan, ethanol 60%, HCL 1%, kloroform, alat bedah, aquades, alkohol 96%, eter, xylol, gliserin, CMC NA, formalin 10 %, serum  tikus, larutan cresolphthalein, larutan buffer, standar kalsium 10mg/dl, larutan EDTA, timbangan digital, tabung eppendrof, pipet eppendrof, erlemeyer, centrifuge Hettich Zentrifugen (buatan Jerman), tabung cuvvet, dan spektrofotometer spectronic 20 (buatan U.S.A).

Pemberian ekstrak daun pegagang kepada tikus penelitian dilakukan per oral melalui sonde modifikasi langsung ke lambung tikus sebanyak 1,2 cc per ekornya, yang diberikan satu kali per hari setiap pukul 15.00 selama dua puluh hari (Abkar, 2009).

Komposisi perlakuan pada penelitian ini adalah sebagai berikut :

TO           : Kelompok tikus yang diovariektomi tapi tidak diberi ekstrak daun pegagang. Kelompok tikus ini terlebih dahulu dianastesia kemudian dieutanasia pada hari ke 41 pasca ovariektomi.

TO 60                     :  Kelompok tikus yang diovariektomi. Pada hari ke 21 pasca ovariektomi, tikus diberi ekstrak daun pegagang 60 mg/kg bb selama dua puluh hari. Setelah hari ke 41 pasca ovariektomi tikus terlebih dahulu dianastesia kemudian dieutanasia.

TO 120  :  Kelompok tikus yang diovariektomi. Pada hari ke 21 pasca ovariektomi, tikus diberi ekstrak daun pegagang 120 mg/kg bb selama dua puluh hari. Setelah hari ke 41 pasca ovariektomi tikus terlebih dahulu dianastesia kemudian dieutanasia.

Sampel darah didapatkan setelah tikus dianastesi menggunakan ketamin, darah langsung diambil  dari jantung melalui bagian apex sebanyak 3ml dengan menggunakan disposable syringe 5 ml. Sampel darah tikus yang diambil dari jantung kemudian, dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditunggu selama 10 menit hingga keluar serumnya. Kemudian serum disentrifugasi dengan kecepatan 3600 rpm, pada suhu 3ºC selama tiga puluh menit dengan Hettich Zentrifugen. Selanjutnya serum dimasukkan kedalam tabung eppendrof  dan disimpan di dalam lemari es pada suhu 4˚C.

Serum yang telah didapat selanjutnya diperiksa kadar kalsiumnya dengan cara cresolphthalein (Ghowenlock, 1988).  Rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga perlakuan dan tujuh ulangan. (Kusriningrum, 2008). Data akan dianalisis statistik  menggunakan SPSS 17.0 for windows software (SPSS, Chicago, IL, USA). Perbedaan diantara kelompok perlakuan dievaluasi menggunakan ANOVA.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Data hasil penelitian pengaruh pemberian ekstrak daun pegagang terhadap kadar kalsium darah tikus putih pasca ovariektomi dapat dilihat pada tabel 4.1.

Tabel 4.1. Rerata kadar kalsium (Ca) darah tikus putih akibat pengaruh ekstrak    daun pegagang pasca ovariektomi.

Perlakuan            Rerata dan   SD

Kadar Kalsium (mgCa/dl)

TO          9,91     0,573

TO 60     10,262     0,099

TO 120  9,977     0,355

Hasil ANOVA menujukkan bahwa pemberian ekstrak daun pegagang melalui tiga macam perlakuan dengan masing-masing perlakuan terdiri dari tujuh ulangan pengaruhnya tidak signifikan (p > 0,05) terhadap kadar kalsium darah tikus putih betina pasca ovariektomi.

Hasil ANOVA menunjukkan bahwa kadar kalsium darah tikus putih pasca ovariektomi pada TO 60 paling tinggi meskipun tidak berbeda nyata (p > 0,05) dengan TO. Sementara itu TO 120 kadarnya lebih rendah daripada TO 60. Kadar paling rendah terdapat pada TO. Gambaran diatas menyimpulkan bahwa pemberian ekstrak daun pegagang  selama dua puluh hari telah menyebabkan meningkatnya kadar kalsium darah tikus pasca ovariektomi meskipun tidak berbeda nyata.

Sampai sekarang, masih terdapat perbedaan hasil tentang efek phytoestrogen terhadap kesehatan tulang pada tikus dan manusia. Perbedaan tersebut dapat disebabkan karena faktor status estrogen dan gizi hewan coba yang digunakan (Weaver and Cheong, 2005).

Gambaran meningkatnya kadar kalsium darah tikus pasca ovariektomi pada penelitian ini, kemungkinan dapat disebabkan karena status estrogen pada tikus sebelum mengalami ovariektomi. Status estrogen pada penelitian ini belum sempat ditetapkan, dalam penelitian ini tidak mengukur kadar estrogen pada tikus sebelum ovariektomi. Keterbatasan dana dan waktu penelitian menyebabkan dalam penelitian ini tidak mengukur kadar estrogen tikus betina.

Penting sekali memilih tikus dewasa kelamin untuk model penelitian ovariektomi, analoginya menopause terjadi pada manusia dan hewan yang telah dewasa kelamin. Dewasa kelamin ditandai apabila tulang tikus telah tumbuh sempurna yang ditandai dengan menutupnya garis epifisis. Disamping itu dewasa kelamin juga menggambarkan bahwa fungsi ovarium sudah sempurna yang ditandai dengan terjadinya birahi dan diikuti dengan ovulasi. Seyogyanya dalam penelitian osteoporosis menggunakan tikus yang sudah tergolong dewasa kelamin. Penggunaan tikus pasca ovariektomi yang masih belum tergolong dewasa kelamin tidak akan memberikan pengaruh penurunan produksi estrogen (Martin and Ruth, 2005 ).

Disamping itu, rendahnya kadar estrogen dapat juga disebabkan karena kurangnya asupan gizi yang memadai sebelum tikus diovariektomi. Kurangnya asupan gizi yang memadai dapat mengganggu ovarium secara fungsional. Siklus ovarium dapat terganggu dan menyebabkan hipofungsi ovarium. Hipofungsi ovarium berhubungan dengan gagalnya sel-sel folikel menanggapi rangsangan hormonal, adanya perubahan kuantitas maupun kualitas sekresi hormonal, menurunnya rangsangan yang berhubungan dengan fungsi hipotalamus-pituitaria-ovarium yang akan menyebabkan menurunnya sekresi gonadotropin sehingga tidak ada aktivitas ovarium. Hipofungsi ovarium dapat menjadi atropi ovarium, jika asupan gizi tidak optimal berjalan lama. Atropi ovarium menyebabkan ovarium lebih kecil daripada ukuran normal, permukaan licin karena tidak ada pertumbuhan folikel sehingga proses reproduksi sama sekali tidak berjalan (Hafez and Hafez, 2000).

Hasil yang diperoleh setelah pemeriksaan kadar kalsium darah, didapatkan kadar paling tinggi pada TO 60 dan diikuti TO 120. Kadar kalsium darah sangat penting pada menopause, karena dapat berfungsi sebagai indikator terjadinya osteoporosis. TO adalah analogi menopause, diharapkan dari tikus yang mengalami ovariektomi ini akan diperoleh kondisi menyerupai defisiensi estrogen dimana kadar kalsiumnya paling tinggi. 

Defisiensi estrogen dapat menyebabkan peningkatkan produksi IL-6. IL-6 diproduksi oleh makrofag, endotelial, fibroblast, serta osteoblast sebagai respon terhadap IL-1. IL-6 merupakan sitokin yang berperan sebagai penghantaran sinyal pada pengaturan proses remodeling tulang. IL-6 bersama dengan IL-1 dan Tumor Necrosis Factor (TNF) memperantarai peningkatan resorpsi tulang akibat adanya defisiensi estrogen. Estrogen menghambat pembentukan IL-6. IL-6 memacu aktivitas osteoclast sehingga terjadi peningkatan resorpsi tulang. Peningkatan resorpsi tulang menyebabkan peningkatan kadar kalsium darah (Nurdin dkk., 2002).

Sementara itu hasil yang diperoleh setelah pemeriksaan kadar kalsium darah, didapatkan kadar paling rendah pada TO. Hasil TO yang diperoleh tidak seharusnya terjadi. Kadar kalsium rendah pada TO kemungkinan disebabkan turunnya estrogen akibat ovariektomi, belum merupakan rangsangan ambang untuk merangsang osteoclast aktif meresorpsi tulang tikus putih betina pasca ovariektomi. Serum sebagai sampel kemungkinan yang menjadi penyebab rendahnya TO. Lisisnya serum karena kesalahan dalam perlakuan dan penyimpanan serum dapat mempengaruhi pembacaan kadar kalsium darah.

KESIMPULAN

Pemberian ekstrak daun pegagan (Centella asiatica) tidak berpengaruh terhadap kadar kalsium darah tikus putih (Rattus norvegicus) pasca ovariektomi.